fa بهینه‌سازی تولید فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی نوترکیب در انگل لیشمانیای غیر بیماری‌زا با طراحی دو سازۀ ژنی </style> <!--stripped--><strong>زمینه و هدف: </strong>پروتیین فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی نوترکیب (rt-PA) یکی از مهم‌ترین ترکیبات ضد لخته می‌باشد که در درمان سکته‌های قلبی و مغزی از اهمیت بالایی برخوردار است. تاکنون روش‌های مختلفی برای تولید پروتیین‌های نوترکیب هترولوگ با استفاده از میزبان‌های پروکاریوتیک و یوکاریوتیک مورد بررسی قرار گرفته است. اخیراً انگل لیشمانیا تارنتولا Leishmania tarentolae (L. tarentolae) به دلایل متعددی از جمله عدم بیماری‌زایی و شرایط ویژه آن در تولید پروتیین‌های پیچیده اهمیت زیادی یافته است. <strong></strong></p> <p dir="rtl" style="text-align: justify"><strong>روش بررسی: </strong>در تحقیق حاضر به‌منظور بهینه‌سازی میزان بیان t-PA نوترکیب انسانی با استفاده از سلول L. tarentolae دو سازه بیانی که هر یک حاوی دو کپی از cDNA t-PA بود طراحی و ساخته شد. این سازه‌ها از طریق الکتروپوریشن به سلول‌های L .tarentolae وارد و در ژنوم انگل ادغام گردیدند. پس از انتخاب کلون‌های ترانسفورم شده، بیان t-PA ترشح شده به محیط کشت سلولی و میزان فعالیت بیولوژیکی آن توسط آزمون‌های وسترن بلات و کرومولیز (Chromolize) بررسی گردید.<strong> </strong><strong></strong></p> <p dir="rtl" style="text-align: justify"><strong>یافته‌ها:</strong> ظهور باند kD64 در غشاء نیتروسلولز حضور t-PA در محیط کشت سلول‌های L. tarentolae ترانسفکت شده را تایید کرد. نتایج آزمون علاوه بر تایید حضور پروتیین t-PA فعال در سوپ سلولی نشان داد که میزان فعالیت پروتیین ترشح شده در سلول‌های ترانسفکت شده با یک سازه، IU/ml375 و در سلول‌های ترانسفکت شده با هر دو سازه برابر با IU/ml480 می‌باشد.<strong> </strong></p> <p dir="rtl" style="text-align: justify"><strong>نتیجه‌گیری: </strong>در این مطالعه میزان فعالیت t-PA بیان شده در محیط کشت سلول‌های ترانسفکت شده، دست‌کم هفت برابر بیشتر از مقدار گزارش شده در مطالعات پیشین در این میزبان و نیز بیشتر از عدد گزارش شده در بسیاری از میزبان‌های یوکاریوتیک دیگر می‌باشد.</p> <p style="text-align: justify"><strong>Background:</strong><strong> </strong>Recombinant tissue plasminogen activator (rt-PA) is one of the most important thrombolytic agentsused in patients with vascular occlusions such as acute ischemic stroke or myocardial infarction. A variety of recombinant protein expression systems have been developed for heterologous gene expression in prokaryotic and eukaryotic hosts. In recent years, Leishmania tarentolae (L. tarentolae), a non-pathogenic trypanosomatid protozoa, has come under consideration because of its safety and immunogenicity as a vaccine vector and special attributes in the expression of complex proteins. This study was done to improve rt-PA expression in this protozoon and create the opportunity for the replacement of rt-PA gene with other genes for the production of other complex proteins.<br> <strong>Methods:</strong><strong> </strong>Two expression cassettes were used for the integration of two copies of t-PA cDNA, one copy in each cassette, into the parasite genome by electroporation. The transformed clones were selected by antibiotic resistancy. The expression of active secreted rt-PA was confirmed by Western blot analysis and Chromolize assay.<br> <strong>Results:</strong><strong> </strong>Appearance of a 64 kD band in nitrocellulose membrane in the Western blot analysis confirmed the presence of full-length rt-PA in the culture media. Chromolize assay showed the expression levels of active recombinant t-PA in single and double transfected L. tarentolae clones- 375 IU/ml and 480 IU/ml of the culture media,respectively.<br> <strong>Conclusion: </strong>The produced rt-PA in the culture media containing the transfected cells was at least seven times higher than what has been reported in previous studies on L. tarentolae or on some other eukaryotic systems.</p> پروتیین نوترکیب,فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی,لیشمانیا تارنتولا Expression,leishmania tarentolae,tissue plasminogen activator,t-PA 629 637 http://tumj.tums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-25-289&slc_lang=fa&sid=1 Hemayatkar M مهدی حمایتکار No گروه بیوتکنولوژی پزشکی، انستیتو پاستور ایران Davoudi N نوشین داوودی No گروه بیوتکنولوژی پزشکی، انستیتو پاستور ایران Davami F فاطمه دوامی No گروه بیوتکنولوژی پزشکی، انستیتو پاستور ایران Majidzadeh-A K کیوان مجید زاده اردبیلی No گروه بیوتکنولوژی پزشکی، انستیتو پاستور ایران Barkhordari F فرزانه برخورداری No گروه بیوتکنولوژی پزشکی، انستیتو پاستور ایران Mahboudi F فریدون مهبودی mahboudi.f@gmail.com Yes گروه بیوتکنولوژی پزشکی، انستیتو پاستور ایران