other همسانه‌سازی ژن و بیان دُمین عملکردی ترومبوپویتین به‌صورت محلول با به‌کارگیری میزبان بیانی رزتاگامی مقاله اصیل Original Article <div style="text-align: justify;"><span style="font-family:yekanyw;"><strong><span style="font-size:10.0pt;">زمینه و هدف:</span></strong> <span style="font-size:10.0pt;">پروتیین ترومبوپویتین یک سایتوکین مهم ‌است که در تنظیم تکثیر سلول‌های بنیادی‌خون‌ساز و تمایز مگارکاریوسیت‌ها دخیل است. به‌دلیل مقدار اندک این پروتیین در خون، در بسیاری از مراکز بیوتکنولوژی این پروتیین به‌صورت نوترکیب تولید می‌شود. هدف از این مطالعه همسانه‌سازی و بیان ژن این پروتیین بود.</span><br> <strong><span style="font-size:10.0pt;">روش بررسی: </span></strong><span style="font-size:10.0pt;">این مطالعه تجربی آزمایشگاهی در مرکز تحقیقات انتقال خون تهران، از مرداد ۱۳۹۵ تا شهریور ۱۳۹۶ انجام گرفته است. سلول‌های رده‌ سلولی </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">HepG2</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> کشت و از آن‌ها </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">RNA</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> جهت الگوی سنتز </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">cDNA</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> استخراج شد. </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">cDNA</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> به‌عنوان الگوی واکنش </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">PCR</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> با استفاده از پرایمرهای طراحی شده قرار گرفت و توالی رمزکننده‌ی دُمین</span> <span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">(Domain)</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> عملکردی ترومبوپویتین جداسازی و وارد پلاسمید </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">pET32</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> شد. وکتور نوترکیب با استفاده از روش ختم زنجیره توالی‌یابی و سپس وکتور نوترکیب به سویه‌ی بیانی رزتاگامی تلقیح شد. القای بیان پروتیین با استفاده از مقادیر مناسب </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> انجام گرفت. باکتری بیان‌کننده تهیه شده، تحت آزمون وسترن بلات قرار گرفت.</span><br> <strong><span style="font-size:10.0pt;">یافته‌ها:</span></strong> <span style="font-size:10.0pt;">با خوانش توالی وکتور نوترکیب، حضور توالی ژن ترومبوپویتین تایید شد. القای بیان، ارزیابی پروتیین کل سلول حاکی از بیان پروتیین هدف به‌صورت محلول در فضای سیتوپلاسمی بود. جایگاه قرارگیری باندهای مربوط به توالی مورد انتظار در ژل پلی‌آکریل آمید و واکنش انجام گرفته با آنتی‌بادی‌های آنتی‌هیستگ در وسترن بلات گویای درستی بیان پروتیین هدف بود.</span><strong><span style="font-size:10.0pt;"></span></strong><br> <strong><span style="font-size:10.0pt;">نتیجه‌گیری: </span></strong><span style="font-size:10.0pt;">باکتری رزتاگامی توانایی بیان پروتیین نوترکیب ترومبوپویتین را به‌صورت محلول دارد. با این روش می‌توان با استفاده از سیستم پربازده باکتریایی، پروتیین نوترکیبی تولید نمود که به‌صورت انکلوزیون‌بادی نبوده و مستلزم مراحل بازپردازی نمی‌باشد.</span></span></div> <div style="text-align: justify;"><strong>Background</strong>: Thrombopoietin (TPO) is an important cytokine that has a critical role in regulating hematopoietic stem cells (HSCs) proliferation and megakaryocyte differentiation. Because of scares amount of this protein in human plasma, in many biotechnological centers around the world, recombinant production of this protein has been carried out. This study was aiming to gene cloning and expression of recombinant thrombopoietin.<br> <strong>Methods</strong>: This research is an experimental laboratory study carried out in Blood Transfusion Research Center, Tehran, Iran, from July 2016 to August 2017. At the beginning HepG2 cell line was cultured and RNA extraction was performed. Extracted RNA was used as template for cDNA synthesis and subsequently the synthesized cDNA was adopted to isolate TPO gene through polymerase chain reaction (PCR) reaction using designed primers. After isolating the TPO sequence from HepG2 cell line, the designated sequence was inserted into pET32 vectors. Recombinant plasmid was amplified by meriting from DH5&alpha; replicating system. The amplified plasmids were sequenced via chain termination method. Next step was transforming the recombinant plasmid into Rosetta-gami bacteria to express the recombinant protein. In order to induce protein expression, an appropriate amount of isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to growth media, then bacterial lysate of expression host was prepared and assayed via polyacrylamide gel electrophoresis and western blotting test.<br> <strong>Results</strong>: After sequencing of recombinant plasmid, it was confirmed that TPO sequence has been successfully colonized in adopted vector. Subsequent to induction of recombinant protein, total cell protein analysis affirmed that recombinant protein has been expressed in its soluble form at cytoplasmic condition. Location of expected recombinant protein band on polyacrylamide gel and reaction of recombinant protein with His-tag monoclonal antibody at western blotting was asserting that expressed protein is the one of interest.<br> <strong>Conclusion</strong>: Rosetta-gami bacteria has capability of expressing recombinant thrombopoietin in its soluble form. By harnessing this method of recombinant protein expression, it would be possible to take advantage of high throughout bacterial expression system which would not produce inclusion body and its product doesn&rsquo;t need further processing and refolding.</div> سایتوکین‌ها, سلول‌های بنیادی خون‌ساز, ترومبوپویتین cytokines, hematopoietic stem cells, thrombopoietin 388 395 http://tumj.tums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-2572-3&slc_lang=other&sid=1 Mohammad Moradi محمد مرادی No Department of Biotechnology, Blood Transfusion Research Center, High Institute for Research and Education in Transfusion Medicine, Tehran, Iran. گروه بیوتکنولوژی، مرکز تحقیقات انتقال خون، موسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون، تهران، ایران. Kamran Atarodi کامران عطاردی No Department of Haematology, Blood Transfusion Research Center, High Institute for Research and Education in Transfusion Medicine, Tehran, Iran. گروه هماتولوژی، مرکز تحقیقات انتقال خون، موسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون، تهران، ایران. Mahshid Mohammadipour مهشید محمدی‌پور No Department of Biotechnology, Blood Transfusion Research Center, High Institute for Research and Education in Transfusion Medicine, Tehran, Iran. گروه بیوتکنولوژی، مرکز تحقیقات انتقال خون، موسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون، تهران، ایران. Kamran Mousavi Hosseini کامران موسوی حسینی mkmousavi@yahoo.com Yes Department of Biotechnology, Blood Transfusion Research Center, High Institute for Research and Education in Transfusion Medicine, Tehran, Iran. گروه بیوتکنولوژی، مرکز تحقیقات انتقال خون، موسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون، تهران، ایران.